核心提示：為了解決葉片氣孔表型無損動態(tài)檢測這一技術瓶頸，華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室楊萬能教授團隊研發(fā)一種低成本、高通量葉片氣孔表型無損檢測新技術，并對不同玉米材料干旱脅迫下的氣孔性狀差異及其潛在應用價值進行了深入研究。此外，團隊開發(fā)葉片氣孔表型分析門戶網(wǎng)站供全球用戶免費開放使用，有助于未來作物大群體葉片氣孔動態(tài)表型分析和遺傳機制解析。
2021年10月30日，植物學知名期刊《Plant Biotechnology Journal》在線發(fā)表了華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室作物表型團隊題為“StomataScorer: A portable and high-throughput leaf stomata trait scorer combined with deep learning and an improved CV model”的研究論文。論文研發(fā)了一種葉片氣孔表型測量新技術，并對不同玉米材料干旱脅迫下的氣孔性狀差異及其潛在應用價值進行了深入研究，為解決作物葉片氣孔表型高通量檢測和遺傳機制解析提供技術支撐。
葉片氣孔由特化的表皮細胞形成，是植物內部和外部環(huán)境之間氣體交換的主要通道。并且氣孔在作物生長過程中對碳和水循環(huán)的調節(jié)起著重要作用，并影響植株的蒸騰強度和光合作用。此外，葉片氣孔運動是一個復雜的調控過程，受到植物內外部多重因素的影響，目前大部分的葉片氣孔研究手段為有損檢測，尚沒有一套成熟的活體葉片氣孔研究體系。因此，在維持葉片完整性的前提下進行氣孔表型檢測，闡釋非生物逆境脅迫等不同環(huán)境下作物大群體葉片氣孔性狀差異，具有重要意義。
本研究利用兩種不同分辨率的便攜式顯微成像儀（TipScope和ProScope HR2）獲取玉米活體葉片氣孔顯微圖像，圖像分辨率分別為（TipScope，4608×3456 pixels，~6 μm/pixel）和 （ProScope HR2，640×480 pixel，~1.5 μm/pixel）?；赥ipScope提取低分辨率的氣孔圖像，研發(fā)FPN深度學習模型提取和分析氣孔數(shù)量和氣孔密度；基于ProScope HR2提取的高分辨率氣孔圖像，研發(fā)RCNN模型區(qū)分打開氣孔和閉合氣孔，并計算開閉氣孔數(shù)量；對于打開氣孔，提出一種改進的基于Chan-Vese（CV）模型的分割方法分割氣孔，進而提取氣孔長、氣孔寬、偏心率、氣孔開度、氣孔面積、氣孔周長總計6個氣孔性狀。實驗結果表明，和真實值比較，本技術氣孔表型檢測精度R2在0.85-0.99，平均相對誤差在0.1%-6.34%之間，證明本技術檢測的準確性。
檢測效率方面，本技術無需對樣本進行預處理。處理500張TipScope圖像耗時約42秒；ProScope HR2獲取一幅圖像的時間約為5~10s，處理500張ProScope圖像耗時約40分鐘。總體來說，提取每個葉片所有氣孔特征的總時間約為10~15s。
圖1 葉片氣孔表型提取和分析流程。A~F：基于TipScope采集圖像計算氣孔數(shù)和氣孔密度；G~R：基于ProScope HR2采集圖像計算氣孔長、氣孔寬、偏心率、氣孔開度、氣孔面積、氣孔周長總計6個氣孔性狀。
為了驗證該方法提取的氣孔性狀的有效性，進一步探索了B73玉米野生型和 Zmfab1a突變體在在正常澆水和干旱脅迫條件下的氣孔表型差異。研究表明，在干旱復水后，Zmfab1a的氣孔打開數(shù)量和氣孔平均面積均高于B73，說明突變體Zmfab1a葉片氣孔干旱響應和恢復能力高于B73，具有更好的抗旱性。
圖2 野生型B73和突變體Zmfab1a在充足水分（WW）和干旱脅迫（DS）條件下的氣孔動態(tài)響應。A.玉米野生型B73在土壤含水量分別為15%、10%、25%和35%的D32、D35、D36和D37上的氣孔圖像。B.在土壤含水量分別為15%、10%、25%和35%的D32、D35、D36和D37上，突變體Zmfab1a的氣孔圖像。C.在充足水分和干旱脅迫條件下，B73和Zmfab1a的4個氣孔特征（開放氣孔數(shù)（OSN）與總氣孔數(shù)（TSN）之比、總氣孔面積、氣孔開放度、單氣孔面積）的4天平均值。統(tǒng)計顯著性檢驗：*P<0.05***P<0.01。D.B73和Zmfab1a4個氣孔性狀在4天內的DS/WW變化曲線
為了進一步評估基于改進CV模型的氣孔分割方法的可行性，本研究還測試小麥、水稻、油菜、萵苣、煙草、馬鈴薯、蠶豆、棉花和大豆其他9種植物，實驗結果表明本技術是可以成功推廣到其他作物葉片氣孔表型檢測。
圖3 不同作物的葉片氣孔分割結果：A.小麥；B.大米；C.油菜籽；D.萵苣；E.煙草；F.馬鈴薯；G.蠶豆；H.棉花；I.大豆。
此外，為了增加該方法的實用性和推廣性，本研究還開發(fā)了葉片氣孔表型處理門戶網(wǎng)站，供全球用戶免費使用，有助于未來作物大群體葉片氣孔動態(tài)表型分析和遺傳機制解析。
圖4 葉片氣孔表型提取和分析門戶網(wǎng)站（http://x40833180q.zicp.vip/）
綜上所述，本研究提出了一種便攜式、低成本（~1000美元）、高通量（~15秒/葉片）的葉片氣孔表型動態(tài)提取和分析方法，并建立門戶網(wǎng)站供全球用戶開放使用，促進未來大群體作物葉片氣孔表型動態(tài)研究和遺傳機制解析。
作者簡介和項目資助：
華中農(nóng)業(yè)大學工學院梁秀英老師和許錫晨碩士生為論文的共同第一作者，楊萬能教授為通訊作者。本研究得到了國家重點研究發(fā)展計劃、國家自然科學基金、湖北省科技重大專項和中央高?；A研究基金的資助。
摘要：
To measure stomatal traits automatically and nondestructively, a new method for detecting stomata and extracting stomatal traits was proposed. Two portable microscopes with different resolutions (TipScope with a 40x lens attached to a smartphone and ProScope HR2 with a 400x lens) are used to acquire images of living stomata in maize leaves. FPN model was used to detect stomata in the TipScope images and measure the stomata number and stomatal density. Faster RCNN model was used to detect opening and closing stomata in the ProScope HR2 images and the number of opening and closing stomata were measured. An improved CV-model was used to segment pores of opening stomata and a total of 6 pore traits were measured. Compared to manual measurements, the square of the correlation coefficient (R2) of the 6 pore traits was higher than 0.85, and the mean absolute percentage error (MAPE) of these traits was 0.02%~6.34%. The dynamic stomata changes between wild type B73 and mutant Zmfab1a were explored under drought and re-watering condition. The results showed that Zmfab1a had a higher resilience than B73 on leaf stomata. In addition, the proposed method was tested to measure the leaf stomatal traits of other 9 species. In conclusion, a portable and low-cost stomata phenotyping method that could accurately and dynamically measure the characteristic parameters of living stomata was developed. An open-access and user-friendly web portal was also developed which has the potential to be used in the stomata phenotyping of large populations in the future.
原文鏈接：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.13741
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